白癜风特征 http://m.39.net/pf/a_6947166.html

摘要：目的建立指纹图谱和多指标定量与化学计量学相结合的湿热痹片质量评价方法。方法采用WatersSymmetryC18色谱柱（mm×4.6mm，5μm），柱温30℃；检测波长分别为nm（检测桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M）和nm（检测连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素）；流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱，体积流量1.0mL/min。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（.版）建立湿热痹片的HPLC指纹图谱，确定共有峰并进行相似度评价；并对桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素的含量测定方法进行方法学验证；基于指纹图谱共有峰峰面积测定结果，采用聚类分析和主成分分析等化学计量学方法对不同批次的湿热痹片进行质量评价。结果湿热痹片HPLC指纹图谱确认了16个共有峰，指认9个共有峰，10批湿热痹片样品相似度均大于0.95，相似度良好；9种成分在各自的质量浓度范围内线性关系良好（r2≥0.），平均加样回收率分别为98.87%、97.44%、97.94%、98.39%、.13%、99.06%、96.80%、98.44%、99.15%，RSD分别为1.42%、1.17%、1.30%、0.91%、0.86%、1.23%、1.08%、1.37%、0.79%；10批次样品中桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素的质量浓度分别在0.～0.、0.～0.、0.～0.、0.～0.、1.～1.、0.～0.、0.～0.、0.～0.、0.～0.mg/g。10批湿热痹片聚为2类；主成分1～6是影响湿热痹片质量评价的主要因子。结论所建立的方法操作便捷、结果准确、重复性好，可用于湿热痹片的质量控制和评价。

湿热痹片由桑枝、连翘、苍术、忍冬藤、黄柏、薏苡仁、川牛膝等12味中药材加工而成，临床上主要用于湿热痹阻所致肌肉或关节红肿热痛，有沉重感，步履艰难，发热，口渴不欲饮，小便短赤等病症的治疗[1]。现代研究表明，湿热痹片能够明显改善佐剂性关节炎大鼠关节滑膜组织中基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3的高表达[2]，调节关节炎模型大鼠外周血T淋巴细胞及细胞因子网络平衡[3]，减少醋酸刺激所致的小鼠扭体反应次数，抑制小鼠腹腔毛细血管通透性增高及二甲苯所引起的耳廓肿胀，减轻类风湿关节炎模型大鼠足爪肿胀程度、降低外周血白细胞数目及关节炎症积分，具有良好的镇痛抗炎作用[4]；其对湿热痹阻型膝关节骨性关节炎[5-6]、急性痛风性关节炎[7]、类风湿关节炎、强直性脊柱炎疗效显著[8]。

湿热痹片现收载于《中国药典》年版一部，为独家生产品种，方中苍术燥湿健脾、祛风散寒，黄柏清热燥湿、泻火除蒸，共为君药；连翘清热散结、疏散风热，粉荜薢祛风除湿，薏苡仁利水渗湿、除痹散结，防己祛风止痛、利水消肿，合为臣药；桑枝祛风湿、利关节，防风祛风止痉、胜湿止痛，威灵仙祛风湿、通经络，忍冬藤、地龙清热通络，共为佐药；川牛膝逐瘀通经、通利关节，引药下行，为使药，诸药合奏，以达祛风除湿、清热消肿、通络定痛之功。苍术为菊科植物茅苍术或北苍术的干燥根茎，苍术素醇、苍术素等聚乙烯炔类和白术内酯II等倍半萜类为其主要活性成分；连翘为木犀科植物连翘的干燥果实，连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷等为其特征成分；桑枝为桑科植物桑的干燥嫩枝，主要含有桑枝多糖、黄酮类和生物碱类等活性成分，桑皮苷A、桑皮苷F和桑辛素M等为其代表性成分。本研究根据“君、臣、佐、使”中医配伍理论，结合中药质量标志物[9-10]以君药所含成分为主，兼顾臣佐使药所含成分的确认原则，将以上9种成分作为湿热痹片定量测定目标成分，用于对湿热痹片的综合质量评价。

中药指纹图谱具有整体性、信息量大、特征性强的特点，是综合评价中药及其制剂质量一致性和稳定性的有效方法，聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）等化学计量学分析方法将指纹图谱提供的多维信息进行充分整合、正确表达，有利于揭示中药及其制剂，尤其是中成药复方制剂复杂成分间隐藏的规律，避免了综合评价时主观加权的弊端。湿热痹片现行质量标准[1]和文献报道[11-13]仅对其方中单味药材所含1～2种成分进行了定量测定研究，中成药复方制剂具有多成分、多靶点，成分间相互协调、相互制约，整体作用等特点，现有的单成分质量控制方法难以全面反映其整体质量，本研究采用HPLC梯度洗脱法，建立湿热痹片HPLC指纹图谱，结合多指标成分含量测定、聚类分析和主成分分析，为更加全面评价湿热痹片整体质量提供参考依据。

1仪器与试药

LC-20AT型高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司；KQ-KDE型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；BPD型电子天平，德国Sartorius公司。对照品连翘酯苷B（批号-，质量分数96.6%）、连翘酯苷A（批号-，质量分数97.2%）、连翘苷（批号-，质量分数95.1%）、白术内酯II（批号-01，质量分数99.9%）和苍术素（批号114-，质量分数99.5%）均来源于中国食品药品检定研究院；对照品桑皮苷A（批号PRF，质量分数99.1%）和桑皮苷F（批号PS079，质量分数99.3%）来源于成都普瑞法科技开发有限公司；对照品桑辛素M（批号CFS，质量分数98.0%）来源于武汉天植生物技术有限公司；对照品苍术素醇（批号BD093，质量分数98.0%）来源于上海毕得医药科技有限公司；专属性试验所用药材来源于天津市中药饮片厂有限公司，经天津医科大学药学院唐铖博士鉴定，苍术为菊科植物北苍术Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎，黄柏为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮，连翘为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实，粉萆薢为薯蓣科植物粉背薯蓣DioscoreahypoglaucaPalibin的干燥根茎，薏苡仁为禾本科植物薏苡Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf.的干燥成熟种仁，防己为防己科植物粉防己StephaniatetrandraS.Moore的干燥根，桑枝为桑科植物桑MorwsalbaL.的干燥嫩枝，忍冬藤为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥茎枝，地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)的干燥体，防风为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，威灵仙为毛茛科植物威灵仙ClematischinensisOsbeck的干燥根和根茎，川牛膝为觅科植物川牛膝CyathulaofficinalisKuan的干燥根；湿热痹片（规格：片心质量0.25g，批号、、、、、、、、、，编号S1～S10）来源于辽宁上药好护士药业（集团）有限公司；乙腈为色谱纯，德国Merck公司；其它试剂为分析纯。

2方法与结果

2.1溶液制备

2.1.1混合对照品溶液的制备精密称取对照品桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素各适量，用70%甲醇溶液制成质量浓度分别为0.、0.、0.、0.、2.、0.、0.、0.、0.mg/mL的混合对照品储备液；精密吸取混合对照品储备液2.5mL，用70%甲醇定容至50mL，制成质量浓度分别为桑皮苷A19.9μg/mL、桑皮苷F6.6μg/mL、桑辛素M10.8μg/mL、连翘酯苷B23.9μg/mL、连翘酯苷A.2μg/mL、连翘苷41.6μg/mL、苍术素醇5.2μg/mL、白术内酯II26.9μg/mL、苍术素49.6μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2湿热痹片供试品溶液的制备取湿热痹片适量，除去糖衣后研细，取约2.0g，精密称定，精密加入70%甲醇溶液25mL，称定质量，超声提取30min，放冷后70%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，得湿热痹片供试品溶液。

2.1.3阴性样品溶液的制备按《中国药典》年版湿热痹片质量标准项下的处方量及工艺，分别制备缺桑枝、缺连翘、缺苍术的3种阴性样品，再按上述方法制成阴性样品溶液。

2.2色谱条件

WatersSymmetryC18色谱柱（mm×4.6mm，5μm），柱温30℃；流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～12.0min，15.0%乙腈；12.0～27.0min，15.0%～26.0%乙腈；27.0～44.0min，26.0%～45.0%乙腈；44.0～63.0min，45.0%～58.0%乙腈；63.0～75.0min，58.0%～15.0%乙腈；体积流量1.0mL/min；检测波长分别为nm（0～27.0min检测桑皮苷A、桑皮苷F和桑辛素M）[14-15]和nm（27.0～75.0min检测连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II和苍术素）[16-18]；进样量10μL。

2.3HPLC指纹图谱建立

2.3.1精密度试验取湿热痹片（编号S1）适量，按上述方法制备供试品溶液，连续进样测定6次，以7号峰（连翘酯苷A）为参照峰，测得其余15个共有峰相对保留时间RSD在0.46%～1.78%，相对峰面积RSD在0.59%～1.86%。

2.3.2稳定性试验取湿热痹片（编号S1）同一份供试品溶液，于0、3、6、9、12、18、24h依法进样测定，以7号峰（连翘酯苷A）为参照峰，测得其余15个共有峰相对保留时间RSD在0.32%～1.52%，相对峰面积RSD在0.48%～1.39%，表明湿热痹片供试品溶液24h内稳定。

2.3.3重复性试验取湿热痹片（编号S1）适量，平行制备6份供试品溶液，依法进样测定，以7号峰（连翘酯苷A）为参照峰，测得其余15个共有峰相对保留时间RSD在0.73%～1.92%，相对峰面积RSD在1.05%～1.72%。

2.3.4方法建立及相似度分析取10个批次的湿热痹片样品各适量，按上述方法制备供试品溶液，依法进样测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（.版）进行分析（参考图谱：S1，对照图谱生成方法：平均数，时间窗宽度：0.1min），生成对照图谱，多点校正法建立指纹图谱，色谱图见图1。共标示出16个共有峰，其中7号峰（连翘酯苷A）稳定性好，色谱响应值较高，保留时间较为适中，故选择其作为参照峰（S）。10批湿热痹片样品相似度和相对峰面积测定结果分别见表1、2。由表1可知，10个批次湿热痹片色谱图与对照指纹图谱（R）相比较，各批次样品的指纹图谱相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.，均大于0.95，表明湿热痹片各批次间共有成分基本一致；由表2可知，10个批次间各成分含有量存在一定差异。

2.3.5主要特征峰归属精密吸取“2.1.1”项下对照品储备液各适量，依法进样测定，记录所检测色谱图，与指纹图谱各主要共有峰进行对比，确认出其中9个色谱峰，分别为1号峰桑皮苷A、2号峰桑皮苷F、4号峰桑辛素M、6号峰连翘酯苷B、7号峰连翘酯苷A、9号峰连翘苷、11号峰苍术素醇、13号峰白术内酯II和14号峰苍术素。

2.49种成分含有量测定

2.4.1专属性试验精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液及“2.1.2”项下各溶液适量，依法进样检测，记录色谱图。结果湿热痹片供试品色谱图中目标成分桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素均能达到有效分离，分离度＞1.5，理论塔板数按各成分色谱峰计均≥，阴性样品对湿热痹片中9种成分的定量测定无干扰，色谱图见图2。

2.4.2线性关系考察精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL，分别用70%甲醇溶液定容至20mL，制成系列质量浓度混合对照品溶液，依法进样测定桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素的峰面积，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得9种成分回归方程、相关系数（R2）和线性范围见表3。

2.4.3精密度考察取“2.1.1”项下混合对照品溶液，连续进样6次，测得桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素峰面积的RSD分别为1.05%、1.28%、1.14%、1.01%、0.56%、0.68%、1.27%、1.09%、0.73%。

2.4.4重复性考察取湿热痹片（S1）适量，按“2.1.2”项下方法平行制备6份湿热痹片供试品溶液，依法进样测定桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素的峰面积，计算各成分含量，结果9种成分含量的RSD分别为1.63%、0.87%、1.75%、1.44%、0.86%、1.34%、1.79%、1.63%、1.20%。

2.4.5稳定性考察取湿热痹片（S1）同一份供试品溶液，于制备后0、3、6、9、12、18、24h依法进样测定，结果湿热痹片供试品溶液24h内稳定，桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素峰面积的RSD分别为1.03%、1.41%、1.26%、1.15%、0.79%、1.08%、1.42%、1.13%、0.89%。

2.4.6加样回收率考察取同一批次9种成分含量已知的湿热痹片（S1）样品适量，除去糖衣后研细，取9份，每份约1.0g，精密称定，按照《中国药典》年版四部要求分别精密加入根据样品含有量另行配制的混合对照品溶液（桑皮苷A0.mg/mL、桑皮苷F0.mg/mL、桑辛素M0.mg/mL、连翘酯苷B0.mg/mL、连翘酯苷A1.mg/mL、连翘苷0.mg/mL、苍术素醇0.mg/mL、白术内酯II0.mg/mL和苍术素0.mg/mL）0.5、1.0、1.5mL各3份，再按“2.1.2”项下方法制成加样供试品溶液，依法进行测定，计算桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素的回收率，结果桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素平均回收率分别为98.87%、97.44%、97.94%、98.39%、.13%、99.06%、96.80%、98.44%、99.15%，RSD分别为1.42%、1.17%、1.30%、0.91%、0.86%、1.23%、1.08%、1.37%、0.79%。

2.4.7样品含量测定取10个批次的湿热痹片样品，每个批次平行制备3份湿热痹片供试品溶液，依法进样测定桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素的峰面积，分别计算9种成分的含量，结果见表4。10批次样品中桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素的质量分数分别在0.～0.、0.～0.、0.～0.、0.～0.、1.～1.、0.～0.、0.～0.、0.～0.、0.～0.mg/g。

2.5基于化学计量学的湿热痹片质量分析

2.5.1CACA是一种通过数据建模简化数据的方法，依据研究对象的某些特征加以归类，建立样本间的相似关系，现已广泛应用于中药及其制剂的质量评价中。以10个不同批次湿热痹片样品中16个共有峰的相对峰面积为变量，采用SPSS26.0软件组间联接系统聚类法，以Euclidean距离为测度进行聚类分析，结果见图3。当类间距离为10时，10批样品可聚为4类，S6、S9、S7为第I类，S4、S10、S1、S5、S2为第II类，S3为第III类，S8为第IV类；当类间距离为15时，10批样品可聚为2类，上述第I、II类聚为一类，第III、IV类聚为一类。结果表明湿热痹片的指纹图谱与样品的不同期间批次有关，可能与制剂所用原药材产地来源、采收季节以及原药材批间质量差异等有关。

2.5.2PCA将10批湿热痹片指纹图谱中16个共有峰的峰面积导入统计软件SPSS26.0中，进行PCA，计算相关系数的特征值和方差贡献率，提取出9种主成分，结果见表5和图4。由表5可知前6个主成分特征值大于1，即4.、3.、2.、1.、1.、1.，对方差的贡献率分别为29.、22.、15.、9.、8.、6.，累计方差贡献率为91.%，大于85%，表明提取前6个主成分即可代表湿热痹片16个共有峰91.%的信息，可以被用于评价湿热痹片的质量。

3讨论

本实验在优化供试品溶液制备方式时，以湿热痹片供试品色谱图中色谱峰数量、分离效果以及定量测定目标成分桑皮苷A、F及桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素综合提取率为指标，依次对提取溶剂（70%乙醇溶液[14-15]、95%乙醇溶液、甲醇[17-19,21]、70%甲醇溶液[16,20]）和提取方式（超声波超声提取[15-21]、加热回流提取[14]）进行了考察，结果显示以70%甲醇为提取溶剂超声提取时出峰较多，色谱峰分离效果较佳，定量测定9种目标成分综合提取效果最佳；随后以70%甲醇为提取溶剂对超声提取时间进行考察（15、30、45、60min）进行对比考察，结果提取30min定量测定9种目标成分均能提取完全，最终确定以70%甲醇超声提取30min作为湿热痹片供试品溶液的制备方法。

本实验在优化色谱条件时，首先对比考察了甲醇-水[14,19-20]、乙腈-水[17,21]流动相系统，结果乙腈-水流动相系统优于甲醇-水，但定量测定目标成分连翘酯苷A和苍术素色谱峰拖尾严重，与相邻杂质色谱峰分离不完全。遂对比考察在流动相水相中加入一定浓度的磷酸溶液[16-17,21]、甲酸溶液和冰醋酸溶液[15]以改善峰形，最终确定以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时，色谱图基线平稳，峰形较好，分离度较高。

本实验采用HPLC梯度洗脱法建立了湿热痹片的HPLC指纹图谱，对9种目标成分桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素进行了定量分析，并采用CA、PCA等化学计量学方法对不同批次湿热痹片进行分析。所建立的方法操作简单、结果准确，10个批次湿热痹片HPLC指纹图谱相似度均大于0.95，指标性成分一致性较好，但批次间目标成分桑皮苷A、桑皮苷F、桑辛素M、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、苍术素醇、白术内酯II、苍术素含有量存在一定差异，可能与制剂生产所用原药材产地来源、采收季节以及原药材批间质量差异等有关，提示药品生产企业